地高辛标记及检测试剂盒I(POD)说明书.doc

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1、 1 DIG Random Labeling and Detection Kit （ POD） (for color detection with DAB) DNA 探针标记和检测试剂盒 产品编号： MK1008 保存期：一年 -20冰冻保存。 用途 ：用于 DNA 探针的随机引物标记及各种膜上杂交和原位杂交。 工作量 ：可用于标记 0.1 3 g 的探针 6 次及 1000 张切片的原位杂交或 12 次 10 10cm 膜上杂交检测。 原理 所谓 DNA 探针，实质上是一段已知的基因片段，应用这一基因片段即可与待测样品杂交。如果靶基因和探针 的 核苷酸序列相同，就可按碱基配对原则进行核酸分子

2、杂交，从而达到检查样品基因的目的。在随机引物法标记反应液中，有随机合成的六聚体核昔酸 (hexanucleotide)作为引物， dATP、dCTP、 dGTP、 dTTP 和 D1G-11-dUTP 作为合成底物，以单链 DNA 作为模板，在 Klenow 酶的作用下，合成掺入地高辛的 DNA 链。以地高辛标记的探针与靶基因 DNA 链杂交后，再通过免疫反应来进行检测。一 免疫检测采用过氧化物酶系统， DAB 显色。敏感性很高。 可用于膜上杂交和原位杂交。 试剂盒内容： 1. DIG Random Labeling Mix(高效 )， 25 l 2.Biotin Mouse Anti Dig

3、oxin 200 l 3. SABC POD 200 l 4. DAB Stock Solution 5ml 5. Blocking Reagent， 5g （ 1） 标记属高效标记反应。以 1 g DNA 探针为例， 1 小时反应即可产生 0.8 g 标记探针， 20 小时可产生 2 g （ 2） 试剂将标记反应所需的引物、核苷酸、 DIG-11dUTP 和 Klenow 酶等混合在一起。一次标记只（ 3） a.DNA 从 10ng 3 g b.不等的 DNA 长度 100bp 10kb c.线形排列或呈高度卷曲之 DNA d.低融点琼脂中的 DNA （ 4） 检测系统抗体为抗地高辛单抗 +

4、SABC。抗地高辛单抗标记生物素，效价 1： 1000-2000（ 膜上杂交）或 1： 1000（原位杂交） 。 （ 5） 显色剂为 DAB，非常稳定。用时 1： 40 （ 6） 试剂盒敏感性达到 0.1pg，足够检测出 1 g 基因组 DNA （ 7） 除用于各种膜上杂交之外，还可用于原位杂交 (ISH)。 操作程序 一 随 2 用灭菌去离子蒸馏水稀释 1 g DNA 至总体积 16 l DNA 热变性：把 DNA 瓶置于沸水中，水浴 10 分钟。然后，迅速地插入碎冰中 3 加 4 l DIG Random Labeling Mix(高效 ),混匀后再离心 2000/r.p.m 5 置 37

5、反应至少 120 分钟。时间越长，产量越高。延长反应时间至 20 小时可明显增加地高辛标记DNA 加入 2 1 10mM EDTA 以中止反应，对于原位杂交和膜上杂交反应来说，标记反应可 告结束，上述反应液置 -20 可根据下表估计标记产量： DNA 模板量 标记一小时 标记二十小时 10ng 45ng 600ng 30ng 130ng 1050ng 100ng 270ng 1500ng 300ng 450ng 2000ng 1000ng 850ng 2300ng 3000ng 1350ng 2650ng 二 （一）杂交总原则 脱氧核苷酸通过磷酸二酯键缩合成长链构成 DNA 的一级结构。两条碱

6、基互补的多核苷酸链按碱基配对原则形成双螺旋，构成 DNA 的二级结构。某些条件 (如酸碱、有机溶剂、加热 )可使氢键断裂， DNA双链打开成单链重新结合。所谓杂交，是具有一定互补顺序的核酸单链， DNA 单链仍然可与序列同源的单链按碱基互补原则结合成异源性双链的过程。 杂交膜可以选择硝酸纤维素膜和尼龙膜。硝酸纤维膜的优点在于本底较低，但只能用于显色性检测，且不能用于重复杂交。尼龙膜分为带正电荷的膜和不带电荷的膜两种。带正电荷的尼龙膜对核酸结合力强，敏感性也较高。不带电荷的膜结合力低，相应敏感性也较低。尼龙膜的优点在于杂交用过的膜，用洗脱液 (0.1 SSC， 0.1%SDS)煮沸 5-10 分

7、钟后去除探针，可用于新的探针杂交。如果对杂交（三）探针浓度 探针浓度是获得理想杂交检测的关键因 素，浓度太高则会导致本底太深；若浓度太低又会导致信号所谓模拟杂交实验，即选择几小片杂交膜，在未转移 DNA 的情况下，进行封闭、不同浓度的探针孵育及随后的免疫检测。以背景能被接受的最高探针浓度为正式杂交实验的浓度。模拟杂交实验不 同浓度的探针可以参考下述方法配制：取 5 l 标记反应液加 1ml 探针稀释液，混匀。取 0.5ml 等倍释后，再取 0.5ml 继续等倍稀释。假设 20 l 标记反应液中含 1 g 标记的探针，则系列稀释探针的浓度分别是： 200ng/ml、 100ng/ml、 50ng

8、/ml、 25ng/ml、 12.5ng/ml、 6.25ng/ml 预杂交和杂交都使用相同缓冲液，不同的仅是预杂交液中不含有探针。下面是几种基本杂交液配 Standard buffer: 5 SSC,0.1%(w/v) N-Lauroylsarcosine,0.02%(w/v)SDS,1% Blocking Reagent Standard buffer+50% formamide 50% formamide(deionized),5 SSC,0.1%(W/V)N-Lauroy 3 lsarcosine,0.02% (w/v)SDS,2% Blocking Reagent High SDS

9、buffer(Church buffer):7%SDS,50% formamide(deionized),5 SSC,2% Blocking Reagent,50mM Sodium Phosphate,0.1% N-Lauroylsarcosine （五） Southern Blotting DNA 片段经电泳分离后按分子量大小排列在琼脂糖凝胶上。 1975 年 Southern 发明了利用浓盐溶液的推动作用将变性的单链 DNA 转移到硝酸纤维素膜上的方法，解决了原位转移的问题。虽然其原理和Southern 印迹杂交包括两个主要步骤把电泳分级的 DNA 转移到固相支持膜上。与标记的 DNA 1

10、 Southern 首先将 DNA 用限制性内切酶消化。准备一定浓度的琼脂凝胶。琼脂凝胶必须是高纯度和核酸级的。电泳后经溴化乙锭染色并在紫外灯下照相后，将需要转移的琼脂糖凝胶切下，放入搪瓷盘中，然后a.0.25M HC1 b.变性液： 0.5N NaoH,1.5M Nac1 c.中和度： 0.5M Tris-HC1,pH7.4,3M Nac1 d.20 SSC： 0.3M 柠檬酸钠 ,3M Nac1 e.2 SSC： 0.03M 柠檬酸钠 ,0.3M Nac1 程序： （ 1）将胶浸入 0.25M HC1 中 10 分钟。 HC1 处理的作用主要是通过去嘌呤使 DNA 分子断裂，因而有利于高分

11、子量 DNA 的转移，但不能处理时间过长。要转移全部小于 10kb 的 DNA 片段时可省略此步（ 2）进入变性 液之前，用蒸馏水漂洗 20-30 （ 3）把胶浸入变性液中，室温浸泡 15 分钟 2 （ 4）蒸馏水漂洗凝胶 2 （ 5）把胶浸入中和液中，室温泡 15 分钟 2 （ 6）在处理凝胶的同时，切一张与胶同样大小的尼龙膜或硝酸纤维膜。硝酸纤维膜用 2 SSC 浸泡。 剪两张 Whatman3# （ 7）准备转移用平器和支架，平器中放 20 SSC （ 8）依次放：处理好的凝胶，硝酸纤维素膜，吸水滤纸，玻璃板，适量重物 (500-1000g) 注意：要检查 PH 值，用硝纤膜时 PH9。

12、要确保各层间没有气泡，否则会发生局部“绝缘”，气泡处的 DNA （ 9）于室温转移 12-20 （ 10）取出转移膜，用 2 SSC （ 11） 固定：可选择下述方法之一进行 DNA 紫外线固定：使用长波紫外线照射 10-20 尼龙膜置 +120烘烤 30 硝纤膜置真空烤箱中， 80减压烘烤 2-2.5 小时，以避免硝纤膜自熔。若无真 空 烤箱， 亦可在普通烤 箱中 65-70烘烤 3-420 SSC 快。 10 SSC 转移速度较快，对于高分子量 DNA( 10Kb) 4 硝酸纤维膜对于 0.5kb 以下的小分子 DNA 结合不牢，转移时容易丢掉。要探测小片时最好用尼龙2 . Souther

13、n 印迹杂交杂交成功的关键因素之一在于选择杂交液。应通过 预实验来选择合适的杂交液。另一个比较重要的因素是标记探针的浓度，一般选择 5-25ng/mla.Standard buffer b.Standard buffer+50% formamide c.High SDS buffer d.Wash Solution I:2XSSC,0.1%SDS e.Wash Solution :0.5XSSC,0.1%SDS 将转移好的尼龙膜或硝纤膜装入塑料袋中，每边各留 2-4mm 空隙。灌注杂交液的一边 留 1cm 空隙。根据所选择的不同预杂交液，采用不同的温度预杂交 4-20 小时 ： Standar

14、d buffer:预杂交温度 65-68 ， Standard buffer+50% formamide:37-42， High SDS buffer:37-42。 使用双链 DNA 探针时，沸水浴 10 按模拟杂交实验所确定的探针浓度将适量探针加入到预杂交液中，配成杂交液，一般浓度 5-25ng/ml100cm2 膜加入至少 3.5ml 使用和预杂交相同的杂交温度，一般杂交 16-20 杂交结束后，取出杂交袋，剪开一个小口，将杂交液倒入带盖的试管中，储存于 -20以备下次使用。这样至少可保存一年。再次使用之前应在冻融之后，加热至 +95 10 分钟以变性探针。杂交液如含有 50%甲酰胺，则在

15、 68变性 10 取出杂交膜，用 Wash Solution I 洗 5 分钟 3 保温冲洗：用 Wash Solution于 68冲洗 15 分钟 2 (六 ) DNA Dot Blotting 此检测方法用于快速定性筛选 DNA。样品可以是纯化 DNA，也可以是细胞碎片 PCR 扩 的 DNA。预杂交和杂交方法与 Southern 试剂： DNA dilution buffer 10mM Tris-HC1； 1mM EDTA,PH8.0； 50 g/ml herring Sperm DNA 将样本 DNA 将样本 DNA 于 +95水浴 10 取 1 l 用紫外线 照射固定或 +120烘烤

16、 30 其后杂交步骤 Southern （七） DAB 试剂： a. .Biotin Mouse Anti Digoxin 200 l b. SABC POD 200 l c. DAB Stock Solution 5ml d.冲洗液： 0.1M Tris-HC1,0.15M Nac1, PH7.4 e.封闭液： 1% Blocking Reagent/0.1M Tris-HC1,0.15M Nac1 5 f.显色缓冲液： 0.1M PBS,150mM Nacl,PH7.4 g.TE 缓冲液： 10mM Tris,1mM EDTA,PH8.0 程序 ： 1. 经过杂交及杂交后的冲洗之后，膜置于

17、冲洗液中平衡 1 2. 用干净的杂交袋或平皿，封闭液室温封闭 60 3. 用冲洗液冲洗 5 分钟 3 次，每次 100ml 。 4. 用封闭液 (e)1： 1000-2000 稀释 Biotin Mouse Anti Digoxin，例如 10 l Biotin Mouse AntiDigoxin 加至 10-20ml 封闭液中 (稀释液 +4可稳定 24 小时左右 )。 将适量稀释抗体 加入杂交袋中37反应 1-2 5. 用冲洗液冲洗 5 分钟 3 次，每次 100ml 。 6. 用封闭液 (e)1： 1000-2000 稀释 SABC，例如 10 l SABC 加至 10-20ml 封闭液

18、中 (稀释液 +4可稳定 24 小时左右 )。 将适量稀释 SABC 加入杂交袋中 37反应 1-2 7. 用冲洗液冲洗 15 分钟 3 次，每次 100ml。 8. 按 1： 40 配制底物显色液： 250 l 储备液加至 10ml 显色缓 冲液中，用前加最终浓度为 0.03 %的 H2O2， 室温显色 5 30 分钟左右。三 原位杂交 所谓原位杂交是指在保存染色体、细胞或组织结构的前提下，用探针定位检查出相关基因序列。结合免疫细胞化学，原位杂交可以揭示出基因在 DNA、 mRNA 原位杂交技术最早 Pardue and Gall 和 John etal。分别在 1969 年发现。最初，放射

19、性标记技术是唯一的方法，其使用受到明显限制。由于 非放射性标记技术的简单、高敏感性，为原位杂交技术广泛应用开避了道路。 1 为了展开染色体，酒精清洁玻片即可。但为了防止细胞和组织的脱落，必须用多聚赖氨酸或 APES2 为了保存形态结构，生物材料都必须予以固定。染色体的固定比较简单，甲醇 /乙酸固定即已足够。如果是石蜡包埋组织，采用福尔马林固定。冰冻切片采用 4%甲醛或 Bouins 固定液固定 30 分钟。应予注意的是， DNA 和 RNA 虽然不和各种交联剂反应。但包围 DNA.RNA 的各种蛋白质和交联剂反应后 3 a. 如果用酶作为标记物，内源性酶必须预先予灭活。如过氧化物酶，可用 1%

20、H2O2/甲醇 30 分钟处理。b.RNA 酶的处理 DNA-DNA 杂交时需要处理 内源性 RNA。 内源性 RNA 的存在，会由于 DNA-RNA 的杂交而增加背景。处理方法： DNase-free RAase(100 g/ml)/2 SSC,37孵育 60 分钟。 (SSC=150mM Nac1,15mM Sodium Citrate,PH7.4) c. HC1 200mM HC1 处理 20-30 分钟可以增加信 /噪比值，其机理尚不清楚。可能与蛋白的 6 d. 在脂膜成分未被固定，脱水、包埋等程序抽提时，可以进一步使用去垢剂处理，如 Triton X-100, Sodium dode

21、cyl Sulfate e. 蛋白酶消化有助于增进探针和核苷酸之间的接触性。消化通常用蛋白酶 K，溶于 20mM Tris-HC1,2mM Cac12， PH7.4 ,37 15-30 分钟。蛋白酶 K 例如对染色体和核的分离部分，可以用 1 g/ml 蛋白酶 K。 4 对染色体 DNA 的原位杂交，必需进行变性处理。热变性越来越常用，它不仅简单，而且效果很好。热变性时，探针和靶基因可以同时变性。将探针加到玻片上，盖上盖玻片。玻片放到 80， 2 分钟后取出冷却至 37。如果是组织切片，变性时间应达到 80 10 分钟 。 组织和细胞 mRNA 的杂 交则不需变性处理。 5 标记探针能够和其序

22、列具有部分同源性的基因非特异性的杂交。这类分子的稳定性总是不及完全同源的杂交分子。分别用不同强度冲洗液可以有效地洗掉非特异杂交的 /探针，而保留特异杂交的探针。冲洗液的强度可通过改变甲酰胺浓度、盐浓度和温度来控制。通常用 2 SSC 50%甲酰胺来冲洗。有时可用更高强度的冲洗液。总的来说，杂交时用高强度缓冲液，冲洗时用低强度的冲洗液 (盐浓度越低，甲酰胺浓度越高和温度越高，则冲洗强度越大 ) 。 6 免疫细胞化学和常规方法一样，必须先进行非 特异性的封闭处理。如探针为地高辛标记时， Tris-HC1缓冲液含“ Blocking Reagent”。此外 0.4M NaCl 的加入也有助于降低背景

23、。 免疫细胞化学中最常用的酶是过氧化物酶和碱性磷酸酶。前者用 DAB 作显色剂。后者用 BCIP/NBT 作显色剂，方法同膜上7 a.探针长度：原位杂交和其它杂交方法不同，它要求较短的探针。因为探针越短，渗透性越强，可以b.探针浓度：浓度越高 ，则杂交速度越快。但过高的浓度也会使背景增加，因此， 宜 选择可接受背景c.硫酸萄聚糖：在水溶液中，硫酸萄聚糖是高度水化物质，因此使得大分子 (如探针 )难以接触到其结d.碱基错配：碱基错配会引起杂交速度及二倍体的稳定性下降。因此在严格的杂交条件下，可以阻止e. 8 适于 DNA 探针 100bp 50% 2 SSC 50mM NaH2PO4/Na2HP

24、O4, PH7.0 1mM EDTA 载体 DNA 任选组合： 1 Denhardts 7 dextran sulfate,1-10% 温度 37-42 杂交时间： 5-16 （ 二 ） 目前，原位杂交已成病理学的一个有力工具，原位杂交可以用于诸如病毒，癌基因突变等领域的检查。尤其是非放射性标记探针技术，为更多的实验室广泛应用原位杂交创造了 条件 。对福尔靶 DNA DNA 1 2 干燥之后，浸入丙酮中 3 玻片移入 1： 50 丙酮稀释的 APES 溶液中，浸泡 5 玻片用蒸馏水略加清洗。干燥备用。处理后的玻片置干燥无尘环境可保存半年。玻片也可用“多3 组织用常规 4% 切片处理：先置 60

25、烘片 30 临 用前配制蛋白酶 K 储备液： Proteinase K,10mg/ml H2O，小量分袋 -20保存。将储备液用 TES稀释成 100 g/ml。（ TES=5mM Tris-HC1,10mM EDTA,10mM Nac1,PH7.4 ） 每张切片用 Proteinase k 20-30 l 37消化 5-15 分钟。消化过程中加盖硅化盖玻片，并置湿盒中。注意消化对组织原位杂交是至关重要的。过度消化会导致切片消失殆尽，化不足则敏感性够，4 蛋白 K 消化后，去 除盖玻片。用 4%甲醛 4固定 5 蒸馏水洗 5 让切片上水分滴下去，并在室温干燥 5 分钟。注意只能让切片上水份减少

26、，不能让切片完全干燥。每张切片加 5-10 l 探针 (大切片需相应增加 ) 设立严格的对照组，每张切片加 5-10 l 切片上加硅化盖玻片，将玻片置 +95变性 6 把玻片放到冰上 1 切片置温盒， 42杂交 3 5 2 SSC 洗 5 分钟 2 次 (室温 ) 0 1 SSC 洗 10 分钟 (42 ) 8 6 切片置于 0 1M TBS 缓冲液中， PH7 4 每张切片加 20-40 l 封闭液： 1%Blocking Reagont/0.1M TBS 15 用封闭液 1： 1000 稀释 Biotin Mouse Anti Digoxin , 每张切片加 20-50 l 稀释试剂，湿盒

27、室温反应 1-2 小时。用 0 1M TBS 洗 5 分钟 3 次。 用封闭液 1： 1000 稀释 SABC， 37 反应 60 分钟。 0 1M TBS 洗 10 分钟 3 次。 配显色剂：将 DAB 储备液用 0 1M PBS， PH7 5 缓冲液 1： 20 稀释。加最终为 0.03%H2O2。 每 张切片加 50 l，一般显色 5-30 下面的程序是用标记 DNA 探针来检测培养细胞中的 mRNA。其它类型的检测可以参照此程序进行。1 注意：所有溶液都必须用 RNase 玻片用多聚赖氨酸处理。直接用 5% CO2 在玻片上培养细胞。所用培养基为无酚红 Dulbeccos 基础 37

28、PBS 清洗细胞。然后用下述固定液室温固定 30 分钟 ： 4%甲醛， 5%乙酸和 0 9%NaC1。室温 PBS 清洗固定细胞，用 70%乙醇储存于 4 70%， 90%和 100%乙醇； 10%二甲苯；然后再用 100%， 90%， 70%乙醇，最后 PBS 用胃蛋白酶消化固定细胞： 0.1%Pepsin/0.1N HC1,37 5-10 PBS 洗 5 分钟后， 1%甲醛固定 10 分钟。 PBS 洗。 其余步骤参照组织切片程序实行。 1 SSC： 150mM Nacl 15mMSodium Citrate PH7.0 20 SSC： 3M Nac1 300mM Sodium Citra

29、te PH7.0 10 SSC： 1.5M Nac1 150mM Sodium Citrate PH7.0 Washing Solution 2 SSC： 300mM Nac1 30mM Sodium Citrate Washing Solution 0.5 SSC： 0.5 SSC+0.1%SDS Washing Solution 0.1 SSC: 0.1 SSC+0.1% SDS N-Lauroylsarcosine:10%(w/v)in Sterile H20,filtered through a 0.2-0.45 m membrane SDS 10%(w/v)in Sterile H2

30、O:filtered through a 0.2-0.45 m membrane Denaturation Solution(for Southern transfer)： 0.5N NaoH,1.5M Nac1 Neutralization Solution(for Soutiern transfer)： 0.5M Tris-HC1,3M Nac1,PH7.4 Blocking Reagent ： 加 10g Blocking Reagent 至 100ml 0 1M TBS， PH7 4 缓冲液中。搅拌以助溶解。 如果必要时，加 0 1%DEPC(dimethylpyrocarbonate

31、) Standard hybridization buffer:： 5 SSC,0.1 N-lauroylsarcosine 0.02% SDS 1% Blocking Reagent Standard hybridization buffer+50% formamide： 5 SSC， 50% deionized formamide, 0.1% N-Lauroylsarcosine,0.02% SDS ， 2% Blocking Reagent High SDS Concentration hybridization buffer： 7%SDS,50% deionizod formamide

32、,5 SSC, 2% Blocking Reagent,50mM Sodium Phosphate,PH7.0， 0.1% N-Lauroylsarcosine 500ml High SDS hybridization buffer 可按下述方法配制 ： 9 100% deionized formamide250ml， 30 SSC83ml， 1M sodium Phosphate,PH7.0 25ml ， 10% blocking solution100ml， 10% N-Lauroylsarcosine 5ml 将上述混合液倒入有 35g SDS 的烧瓶中 (通风橱 )。搅拦促进溶解，最后

33、加入灭菌水至 500 ml。储存于 -20 Detection Washing buffer： 0.1M Tris-HC1,0.15M NaC1,PH7.4 Detection buffer： 0.1M PBS,150mM Nac1,PH7.4 TE buffer： 10mM Tris-HC, 1mM EDTA,PH8.0 玻璃和塑料器皿的硅化：先将待硅化器皿放入玻璃真空干燥器中；加 1ml 二氧二甲基硅烷于一小烧杯中，放入干燥器。将真空干燥器与真空泵相连。抽气至二氯甲基硅烷沸腾。关闭真空泵，保持干燥器的真空。 1-2 小时后，慢慢往 干燥器内通气，取出器皿 180烘烤 2 小时，塑料器高压消

34、毒，用前用水冲洗干净。 核酸探针的标记及杂交是一个很复杂的过程，步骤多耗时长，影响因素多。要想获得理结果，每无菌操作：标记和杂交的各种溶液应高压灭菌；含 SDS， Tween20 的溶液应在滤膜除菌后加入其它溶原位杂交：每步反 有关参考文献 1.Rigby,P.W.J,et al.Labeling deoxyribonucleic acid to high specific activity in nick translation with DNA Polymerase I.J.Mol.Biol.(1997)113:237-241. 2.Langer,P.R.et al.Enzgmatic S

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